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什么是液体活检?

在癌症诊断、术后器官移植监测和产前基因检测中,有一件事是普遍的:早期检测起着关键作用。虽然有创活检程序历来被用于监测疾病的相关生物标志物,但在过去几年中,无创液体活检技术取得了显著进展。不同类型的体液可用于进行液体活检,血液是肿瘤最常见的样本类型。简单的抽血有可能实时监测治疗反应和早期癌症检测。正常组织和肿瘤会脱落包括DNA在内的细胞或细胞内容物,这种释放到外周血中的循环细胞游离DNA (cfDNA)是癌症患者血液中广泛使用的分析物。使用液体活检寻找生物标志物越来越受欢迎,已经有一些FDA批准的基于ngs的辅助诊断测试正在使用,用于监测一系列实体肿瘤(如Guardant360 Dx, FoundationOne liquid CDx)。

细胞游离DNA分离和质量控制

尽管来自正常细胞和肿瘤细胞的DNA碎片能够进入血液,但肿瘤特异性cfDNA的浓度非常低。这种低浓度和小片段大小意味着标准的基因组DNA分离技术不适用于cfDNA分离。因此,选择一种稳健的cfDNA分离工艺是确定cfDNA纯度和产率的关键步骤,它影响下游的分析过程。cfDNA提取后,特定检测的分析有效性取决于检测的敏感性和特异性。

为了校准和验证分析前和分析工作流程,Horizon Discovery提供了在合成基质中制定的cfDNA参考标准,该合成基质模拟人类血浆或缓冲液。这些细胞系衍生的参考物质可与患者样品交换,具有高度的特征,并有助于cfDNA测定方法的开发、验证和常规质量控制(定性和定量)。

从血浆中分离cfDNA的各种提取化学方法已被开发出来,其中主要涉及硅基纯化柱和磁珠基试剂盒。几项研究分析了不同提取方法的效果,并显示了产量和片段大小的差异(1-4)。影响DNA提取过程的其他因素是物理条件,如pH值、温度和离子强度。在cfDNA提取液中,高分子量基因组DNA、蛋白质、金属离子和其他常见杂质的存在也会对下游分析分析中使用的某些分子过程产生不利影响。

为了应对不同提取试剂盒引入的可变性,Horizon Discovery开发了一种新的合成基质cfDNA参考标准,该标准与最广泛使用的提取试剂盒兼容。随着新产品的推出,Horizon Discovery现在提供了两种合成基质中的cfDNA参考材料:Multiplex I cfDNA in synthetic matrix I (HD817)及合成矩阵II (HD917).这些产品在人工基质配方的组成上是不同的,因此它们与不同的提取试剂盒具有不同程度的兼容性(图1)。这些参考材料为客户提供了更大的灵活性,根据他们对某一提取试剂盒的偏好来选择他们首选的控制材料。

图1cfDNA标准材料中使用的两种不同类型的合成基质与不同的提取试剂盒具有不同程度的兼容性。试剂盒之间的相对兼容性和提取效率为选择合适的参考标准提供了更大的灵活性

标准物质的分析评估

使用cfDNA进行早期癌症检测和移植排斥反应监测的一个关键挑战是患者血液中突变DNA或供体DNA的比例非常低。cfDNA的高碎片性、极低浓度和极低的突变等位基因部分使得准确检测遗传变异具有很大的挑战性,并可能限制临床应用。因此,cfDNA的精确分析需要使用具有良好特征变异的适当对照。在矩阵I和II中,除了提供野生型等基因产物(0%等位基因频率)外,还提供5%、1%和0.1%的突变等位基因频率(MAF)的cfDNA参考物质。

cfDNA参考标准中的关键变异在生产过程的多个阶段进行验证,以确保基因组成的准确性和一致性,从细胞混合阶段开始,直到从人工血浆中恢复cfDNA片段的最后阶段。对从HD917中提取的cfDNA片段进行数字PCR分析,以预期的等位基因频率和高重复性确认了所有声称的变异(图2)。仅使用HD917,它代表了两种合成矩阵(包括HD817)的预期结果。

图2所示。用数字PCR方法检测了HD917 (Multiplex I cfDNA in Synthetic Matrix II)在低突变等位基因(Mutant Allele Fraction, MAF) 1%和1.3%的情况下的8个不同的突变体。使用QIAamp循环核酸试剂盒提取cfDNA。

用于制作参考标准的细胞混合物的整个外显子组测序也证实了所声称的变异的准确检测,证明了其在多个诊断分析中的实用性。除了变异验证外,还验证了DNA片段图谱(平均170 bp)和DNA浓度,这意味着该参考标准也可用于校准cfDNA物理参数的测量。

总结

Horizon的参考标准是从细胞系衍生而来的,这使它们成为模仿人类基因组复杂性的优秀可再生资源。使用合成基质构建的cfDNA参考材料是一种具有成本效益的人类血浆替代物,因为人类血浆存在批次之间的差异,并且需要特殊的存储需求。随着两种不同的合成基质的可用性和与cfDNA提取试剂盒的一系列兼容性,Horizon的cfDNA参考标准是一个很好的分析控制,以实现从开始到结束的液体活检分析的信心。

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